Real-Time-PCR

Die Methode der Real-Time-PCR ist hochsensitiv, spezifisch und ermöglicht darüber hinaus die exakte Quantifizierung der untersuchten Parameter, z.B. Bakterien in einer Patientenprobe. Die isolierte und aufgereinigte bakterielle DNA (Erbsubstanz) stellt den Ausgangspunkt für die weiteren Schritte dar.

Die konventionelle PCR (polymerase chain reaction, Polymerasekettenreaktion) ist eine molekularbiologische Untersuchungsmethode, bei der kleinste DNA-Mengen durch Vervielfältigung nachweisbar werden. Dabei vervielfältigt ein Enzym (Taq-Polymerase) die gesuchten artspezifischen Genfragmente (Zielsequenzen). Für jede Zielsequenz werden spezifische Primer (kurze DNA-Fragmente) als Startpunkt für die Taq-Polymerase verwendet, die in einem exponentiellen Prozess zahlreiche Kopien der Zielsequenz synthetisiert. Das Ergebnis der Reaktion kann über weitere Laborschritte, z.B. Gelelektrophorese, sichtbar gemacht werden.

Die konventionelle PCR mit Endpunktbestimmung liefert allerdings nur sehr begrenzte Informationen über die Anzahl der in einer Probe vorhandenen Bakterien. Eine verlässliche Quantifizierung ist nicht möglich.

Im Gegensatz dazu ermöglicht die Real-Time-PCR in einem voll automatisierten, validierten Prozess eine exakte Quantifizierung der Zielsequenzen. Durch die Aufzeichnung des Reaktionsverlaufes der Vervielfältigung kann die genaue Bakterienzahl in der jeweiligen Probe ermittelt werden.

Die Real-Time-PCR verwendet zusätzlich zu den für jede Erreger-DNA spezifischen Primern in derselben Reaktion ein weiteres speziesspezifisches DNA-Fragment (TaqMan®-Sonde), das innerhalb der gesuchten Zielsequenz bindet. Diese zusätzliche Sonde bedingt die hohe Spezifität der Methode. Bei der Vervielfältigung der Zielsequenz wird die fluoreszenzmarkierte TaqMan®-Sonde durch die Exonuclease-Aktivität der Taq-Polymerase von der Zielsequenz abgespalten und zerstört. Bei diesem Abbau der Sonde wird ein Fluoreszenzsignal freigesetzt, das durch automatische Laserdetektion im Reaktionsgefäß online gemessen und direkt aufgezeichnet wird. Die Intensität des Fluoreszenzsignals ist somit ein Maß für die Menge des gebildeten Produktes und direkt proportional zur Ausgangsmenge des gesuchten Erregers in den Patientenproben.

Im Gegensatz zu konventionellen PCR-Verfahren sind bei der Real-Time-PCR keine weiteren Arbeitsschritte im Labor erforderlich.